总结:检验各种细胞手工计数方法大全

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随着科技的进步,检验专业的临床应用也不断发展更新,越来越多的检验工作都逐步机器化,以往我们书本所学到的关于各类细胞的手工计数方法也都被各种仪器所替代,慢慢的大家都开始遗忘了例如红细胞、白细胞、精液等手工计数的方法了,但是闲鱼这里必须说,即使很多检测都能使用仪器做到了,但是手工显微镜的检查也是每个检验人员必须熟练掌握的,当仪器出现问题的时候,手工显微镜检查就是最好的验证手段,所以我们不仅需要学习这些手工计数的方法,也要在工作中灵活运用,闲鱼所在的检验科就常常对血常规结果异常的进行手工计数验证。

一、红细胞计数

1.原理:用等渗稀释液将血液稀释一定倍数,充入血细胞计数池,计数一定体积内的红细胞,经换算求出每升血液中红细胞数量。

2.操作:

1)取一支试管1支,加红细胞稱释液2.0ml

2)用清洁干燥微量吸管取末梢血10μl,擦去管外余血后加至红细胞稀释液底部,再轻吸上层清洗吸管2-3次立即混匀。

3)混匀后,用干净微量吸管将红细胞悬液充人计数池,不得有空泡或外溢,充池后静置2-3min后计数

4)高倍镜下依次计数中央大方格内四角和正中共5个中方格内的红细胞。对压线细胞按“数上不数下、数左不数右”的原则进行计数。

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3.计算:

红细胞数/L=5个中方格内红细胞数×5×10×200×10^6

=5个中方格内红细胞数×10^10

=5个中方格内红细胞数÷100×10^12

公式中:
        ×5        5个中方格换算成1个大方格;
        ×10        1个大方格容积为0.1μl,换算成1.0μl;
        ×200        血液的实际稀释倍数应为201倍,按200是便于计算;
        ×10^6        由1μl换算成1L。

二、白细胞计数

1.原理:用等渗稀释液将血液稀释一定倍数,充入血细胞计数池,计数一定体积内的白细胞,经换算求出每升血液中红细胞数量。

2.方法

1)取小试管1支,加白细胞稀释液0.38ml

2)用微量吸管准确吸取血样20μl,擦去管外多余血液,将吸管插入小试管中稀释液的底部,轻轻将血放出,并吸取上清液清洗吸管两次,混匀。

3)待红细胞完全被破坏,再次混匀后,用微量吸管吸取混匀液10μl充池,静置2-3分钟,待白细胞下沉。

4)用低倍镜计数四角大方格内的白细胞数,对压线细胞按“数上不数下、数左不数右”的原则进行计数。
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3.计算:白细胞数/L =N/4×10×20×10^6 =N/20×10^9

公式中:
        N        4个大方格中白细胞的总数
        ÷4        为每个大方格(即0.1μl)内白细胞平均数
        ×10        1个大方格容积为0.1μl,换算为1.0μl
        ×20        血液稀释倍数
        10^6        由1μl换算成1L

4.一些贫血患者血液中有核红细胞增多,会计数在白细胞总数内,这会对结果造成干扰,需要使用白细胞校正公式对结果值进行校正。

校正公式:白细胞校正数/L=M×(100/100+N)

公式中:
        M为未校正前白细胞数,N为在白细胞分类时,计数100个白细胞的同时计数到的有核红细胞数。

三、血小板计数

1.原理:将血液用适当的稀释液作一定量稀释后,混匀注入计数池内计数,再算出每升血液中血小板数。

2.方法:

1)小试管内加血小板稀释液(草酸铵)0.38ml。取动物静脉血20μl,迅速挤于稀释液内,立即充分摇匀。

2)放置4-10min,待溶液呈透明红色,说明红细胞已经充分溶解,充分摇匀,取1小滴加入计数池。

3)放置10-15min,待血小板完全下沉后,先将中央大方格移至低倍镜视野内,再转以高倍镜,数5个中方格内的血小板数

4)血小板大小形态不一致,但均呈折光的发亮淡蓝色小点,大小约红细胞的1/7-1/2,呈不规则圆形或长圆形。在计数时必须来回扭动显微镜微调,不要遗漏计数。
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3.计算:

5个中方格血小板总和×1/50mm^3(5个中方格的体积)×1/20(稀释倍数)=1/1 000mm^3,故5个中方格的总和×1000=lmm^3血液的血小板数。

PLT/L=5个中方格内PLT (N)×10^9/L=N×5×10×20×10^6 /L

公式中:
        N        5个中方格中血小板的总数 ;
        ×5        5个中方格换算成1个大方格;
        ×10        1个大方格容积为0.1μl,换算为1.0μl
        ×20        血液稀释倍数
        10^6        由1μl换算成1L

四、网织红细胞计数

1.原理:

网织红细胞是未完全成熟的红细胞,包体较一般红细胞稍大,胞浆中尚有嗜碱性残存物质,可被煌焦油蓝等染成蓝色颗粒状和线状及网状结构物。网织红细胞的数量可用百分率或每立方毫米血液中的绝对值数来表示。

2.方法

1)血膜片制备:

2)染色:取试管一支,用毛细管或枪头于试管中加入染液2~5滴,然后再加入新鲜血液1滴轻摇混合,染色10~15min。

3)制片:取载物片一片,用毛细管或枪头吸取血液染色液1小滴于载物片上,并用推片约45度角推制成舌型血膜片,自然干燥备用。

4)观察:用显微镜观察,取血膜片滴入香柏油1滴,将血膜片置于显微镜载物台,用油镜观察网织红细胞。
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3.计数

1)Miller窥盘法计算公式:

网织红细胞(Retic)= B格内网织红细胞(Retic)数/ A格内红细胞(RBC)数x9

公式中(配合上图):
        窥盘中有面积比例为 1:9 的 2 个正方形技术方格,只需计数 1/9 小方格内的红细胞即可准确估量出整个大方格内的红细胞数量。
        A=1/9*B,即A中见1个RBC则B内见9个

2)取计数器在油镜下检查计数红细胞,即计数红细胞中网织红细胞的数量,检查计数100个红细胞中网织红细胞的数量,并得出千分率再除以10即为百分率。

网织红细胞百分率=10/1000个红细胞中网织红细胞的数量

五、嗜碱性点彩红细胞计数实验(很少用到)

1.原理

红细胞中的嗜碱性物质用瑞氏或美蓝染液显示出红细胞中的蓝色点彩、然后计数点彩红细胞占红细胞总数的百分数。

2.方法

1)用通常的方法制成薄血膜,干燥后用甲醇固定,

2)用碱性美益蓝染40s水洗,晾干。

3)用低倍镜选择红细胞分布均匀的部位,然后换油色计数,红细胞呈强蓝色,点彩颗粒呈深蓝色.

3、计数方法:

基本与网织红细胞相同,计数50个视野中的点彩红细胞同时计数其中5个视野的红细胞总数,即可算出点彩红细胞的百分数,如用瑞氏染色其方法同血片染色。

计算公式:点彩红细胞百分率=10/1000个红细胞中点彩红细胞的数量

六、脑脊液(胸腹水)有核细胞计数

1.原理

(1)清亮或微浑的脑脊液(胸腹水)标本,可以直接计数细胞总数,或稀释后再直接计数,将结果乘以稀释倍数。

(2)可采用直接计数法计数白细胞,或稀释后再直接计数,将结果乘以稀释倍数。

(3)白细胞直接计数后,在高倍镜下根据白细胞形态特征进行分类计数。也可采用Wright染色后,油镜下分类计数。

2.方法

(1)非血性标本:小试管内加入冰醋酸1~2滴,转动试管,使内壁沾有冰醋酸后倾去,然后滴加混匀脑脊液3(胸腹水)~4滴,数分钟后,混匀充人计数池,按血液白细胞计数法计数。

(2)混浊或血性标本:将混匀脑脊液(胸腹水)用1%冰醋酸溶液按血液白细胞计数法稀释后进行计数。

3.计算

为剔除因出血而来的白细胞数,用下式公式进行校正。脑脊液(胸腹水)白细胞校正数=脑脊液(胸腹水)白细胞计数值一出血增加的白细胞数出血增加的白细胞数=外周血白细胞数x脑脊液(胸腹水)红细胞数/外周血红细胞数
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4.公式

1)澄清标本

按血液白细胞计数法计数换算略麻烦,直接计数5个大方格比较方便,此时计数四角大方格和中央大方格内的白细胞数

脑脊液(胸腹水)白细胞数/L=N×2×10^6/L=2N×10^6/L

公式中:
        N        5个大方格内的白细胞总数
        ×2        5个大方格的容积为0.1×5=0.5ul,换算为1.0ul只需要乘以2;
        ×10^6        由1.0ul换算为1L;


也可以充两个计数室,计数10个大方格。

2)浑浊/血性标本

脑脊液(胸腹水)白细胞数/L=N×2×20×10^6/L=40N×10^6/L

公式中:
        ×2        将5个大方格的白细胞数换算为1.0ul的白细胞数;
        ×20        脑脊液(胸腹水)的稀释倍数;
        ×10^6        由1ul换算为1L;


也可以充两个计数室,计数10个大方格。

七、精子计数

1.原理:

将精液用适当的稀释液作一定量稀释后,混匀注入计数池内计数,再算出每毫升精液中精子数。

2.方法

1).于小试管内加精子稀释液0.38ml,取液化精液20μl,加入稀释液内混匀。

2).充分摇匀后,滴入改良 Neubauer计数板的计数池内,静置1~2分钟,待精子下沉后,以精子头部作为基准进行计数,计数中央大方格内四角和正中共5个中方格内的精子数
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3.计算

1).如每个中央中方格内精子少于10个,应计数所有25个中方格内的精子数。

2).如每个中央中方格内精子在10~40个,应计10个中方格内的精子数。

3).如每个中央中方格内精子多于40个,应计数5个中方格内的精子数。

公式:

精子数=计数结果/计数中方格数×25×1/计数池高度×20×10^3/ml

=计数结果/计数中方格数×1/计数池高度×5×10^3/ml


至此,我们总结归纳了在临床检验中经常会用到的细胞手工计数大部分方法,闲鱼参考了以下文献并作了相关补充,使其更能被理解,将这些全部折腾完,闲鱼表示很头痛,希望大家看了能有所收获。

本文引用文献:最全的各种细胞计数方法总结,赶紧收藏

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    • 西枫里博客

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        • 闲鱼 【博主】

          @西枫里博客 看完了,王彭老师是一位伟大的检验科医生,微生物学真的很难,属于检验专业里面很特殊的一种,专业性需要也很强,能做到这样真的是很厉害,学习的榜样。也确实如文中所说,检验科是一个辅助科室,很尴尬的地位。

        • 西枫里博客

          这个太专业了,能不能给血常规的每个指标来个简单直白的科普???